Tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNALP), mainly from bone and liver, is a serum biomarker of skeletal disease. Although the bone and liver TNALP isoforms share an identical protein structure, differences in their post-translational glycosylation alter protein structure and function, adding complexity to TNALP as a biomarker.

Osteoblasts produce four bone alkaline phosphatase (BALP) isoforms, essential for normal bone and mineral metabolism. TNALP activity is reduced in the genetic disorder hypophosphatasia (HPP), whereas unexplained elevations occur in benign transient hyperphosphatasemia (BTH). In chronic kidney disease, elevated BALP levels may provide prognostic insight into bone turnover and cardiovascular disease. However, limited understanding of TNALP glycosylation and insufficient differentiation between liver ALP and BALP underscore the need for more sensitive and specific clinical assays.

The aim of this thesis is to characterize TNALP glycosylation and evaluate its influence on BALP as a biomarker. Structural differences in glycosylation patterns across cell types and TNALP isoforms were examined with novel structural methods and established BALP detection techniques.

Paper 1 applies glycoproteomics to define glycan structures and site occupancy in human TNALP. Paper 2 investigates the functional role of N-glycan sites in enzymatic activity, folding, and stability of TNALP, using site-directed mutagenesis and molecular dynamics simulations. Paper 3 expands the glycoproteomic profile with HPLC, gel electrophoresis, and analyses of TNALP expressed in multiple cell types, asfotase alfa (recombinant ALP for HPP treatment), the B2 BALP isoform, and TNALP in an overexpression mouse model. Paper 4 examines BALP status, TNALP isoform profile and glycosylation patterns in children with BTH.

The findings indicate that TNALP has five fully glycosylated sites with high heterogeneity in glycosylation, core fucosylation and sialylation between sites and cell sources. Glycan interactions with the protein are essential for normal folding and function. Increasing evidence in terminal sialylation variations might explain the differences between the TNALP isoforms and aid in developing new isoform-specific assays. However, more studies are needed to confirm these structural differences.

Alkaliskt fosfatas (ALP) är en vanlig blodmarkör som används för att bedöma benhälsa. Det mesta av ALP i vårt blod kommer från en form som kallas vävnadsospecifikt alkaliskt fosfatas (TNALP), som huvudsakligen produceras i levern och i benbildande celler. TNALP‑molekylerna från dessa vävnader har samma proteinstruktur, men de är dekorerade med olika sockermolekyler, så kallade glykaner. Dessa glykaner kan påverka funktionen av proteinet och gör ALP till en mer komplex biomarkör.

TNALP‑molekyler från ben, så kallade ben ALP (BALP) isoformer, är avgörande för en normal ben- och mineralomsättning. Förändrade TNALP‑nivåer ses vid flera medicinska tillstånd, såsom hypofosfatasi där TNALP‑aktiviteten är för låg, eller vid kronisk njursjukdom och benign övergående hyperfosfatasemi där nivåerna är för höga. Förhöjda BALP‑nivåer hos patienter med kronisk njursjukdom kan ge viktig information om både benhälsa och risken för hjärt‑kärlsjukdom. Trots detta saknas fortfarande detaljerad kunskap om de glykanstrukturer som dekorerar TNALP och hur denna information kan användas för att säkert skilja mellan ben‑ALP och lever‑ALP i rutinmässiga blodprov. Mer precisa och känsliga metoder behövs.

Syftet med denna avhandling är att, med hjälp av nya strukturella metoder i kombination med etablerade laboratorietekniker, utforska kolhydratstrukturerna och hur de påverkar funktionen och användbarhet av TNALP som biomarkör. I artikel 1 undersöktes glykanstrukturerna vid varje bindingsställe. I artikel 2 undersöktes hur specifika glykanbindingsställen påverkar strukturen och funktionen av TNALP. I artikel 3 jämfördes glykanstrukturen i TNALP från olika mänskliga och mus cellkällor. I artikel 4 studerades BALP‑nivåer och TNALP‑isoformer vid benign övergående hyperfosfatasemi och deras möjliga kopplingar till glykanstrukturer.

Våra resultat visar att TNALP har fem glykanbindningsställen fullt upptagna av många olika typer av glykanstrukturer, och att glykanmönstret varierar beroende på celltyp. Dessa glykaner är avgörande för korrekt proteinveckning och funktion. Det identifierades även nya glykanstrukturer och tecken på att variationer i glykanernas "sockertoppar" kan hjälpa till att skilja TNALP isoformer från varandra. Denna kunskap kan bidra till att utveckla framtida diagnostiska tester som kan skilja ben‑ALP från lever‑ALP. Ytterligare studier behövs för att helt bekräfta dessa strukturella skillnader.