Waran används sedan 60 år som blodförtunnande läkemedel för att förebygga eller förhindra progress av blodproppssjukdom. I Sverige behandlas årligen cirka 1 % av befolkningen med waran. I Östergötland uppskattas antal waranpatienter till cirka 3000. Waran hämmar enzymet VKORC1 som ansvarar för vitamin K omsättningen i kroppen. Vitamin K behövs som kofaktor för flera koagulationsfaktorer.

Behandling med waran är förenad med en svår balansgång och kräver en noggrann dosering. Stora skillnader i dosbehov mellan olika individer, beroende på ärftliga och miljöfaktorer, gör waran till ett svårhanterligt läkemedel. För låg dos medför otillräcklig effekt och därmed risk för minskat skydd mot blodproppssjukdom. För hög dos leder till allvarliga blödningskomplikationer. Uppskattningsvis 1 – 3 % livshotande blödningsfall registreras årligen efter waranbehandling. Därför måste behandlingen kontrolleras noga med analys av protrombinkomplex (PK) och dosjusteringar göras med ledning av resultaten. Två olika metoder finns att använda för mätning av PK. I Norden och i Japan används Owrens metod (utvecklat i Norge under 40- och 50-talet av Paul Owren). I de flesta andra länder används Quickmetoden (utvecklat i USA under 30-talet av Armand Quick). Den senare metoden är förenad med stora variationer mellan olika analyslaboratorier. I Norden, däremot, där Owrens metod används finns det ofta bra överensstämmelse mellan olika laboratorier i PK-resultat. Beroende på vilken PK-metod som används, kan samma patient få olika warandoser vilket ökar risker för under- eller överbehandling.

Vi har i samarbete med flera sjukhus och antikoagulationsmottagningar (AK-mottagningar) i sydöstra Sverige studerat dels mekanismerna bakom skillnader i warandos mellan olika patienter, och dels tittat varför de olika PK-metoder skiljer sig så mycket som de gör.

I studien har vi identifierat genetiska varianter av enzymet VKORC1. Av de undersökta patienter som gick på waran under längre tid, har vi identifierat en grupp som markant skiljde sig från de övriga. Denna grupp hade warandoser som var betydligt lägre än de övriga. När vi kartlade deras arvsmassa, fann vi att lågdospatienterna hade genvarianten VKORC1*2. Dessutom hade patienter med denna variant svårigheter att få stabila PK-värden. De gjorde också fler besök på AK-mottagningar än andra patienter. Vi har därför konstaterat att en del av de problem som är förenade med waranbehnadlingen kan förklaras av VKORC1*2 varianten. Vetskap om denna variant skulle troligen underlätta behandlingen framför allt under inledningsfasen då patienter med VKORC1*2 riskerar blödningar på grund av överdosering.

Vi har identifierat att provförspädning enligt Owrens metod är nödvändig för harmonisering av PK-resultatet mellan olika länder. Quickmetoden använder inte förspädning av patientprov till skillnad från Owrens metod. När vi modifierade en Quickmetod genom att förspäda prover enligt Owrens metod noterade vi en bra överensstämmelse mellan de två olika metoderna. Däremot var resultatet sämre utan provförspädning. Vi anser att Quickmetoder kan uppnå lika bra resultat som Owrens metod om prover förspäds som i Owrens metod. Det skulle gynna patienter som reser mellan olika regioner eller länder och leda till en bättre övervakning av waranbehandling internationellt.

I studien har dessutom en metod för mätning av waran i blodet utvecklats. Metoden som är den enda i sitt slag i Norden ger möjlighet att studera hur läkemedlet beter sig i kroppen. Vi har med denna metod kunnat upptäcka patienter som har onormala nedbrytningar av waran.

Warfarin was introduced more than 60 years ago and is used worldwide for the prophylaxis of arterial and venous thromboembolism in primary and secondary prevention. The drug is orally administered as a racemic mixture of (R)- and (S)-enantiomers. The (S)-form is mainly responsible for the anticoagulant effect and is metabolised by CYP2C9 enzyme in the liver microsomes. Warfarin exerts its pharmacological action by inhibiting the key enzyme (VKORC1) that regenerates vitamin K from an oxidised state to a reduced form. The latter is a cofactor for the post-translational modification of a number of proteins including coagulation factors II, VII, IX and X. The vitamin K-dependent modification provides these factors with the calcium-binding ability they require for the interaction with cell membranes of their target cells such as platelets.

Warfarin is monitored by measuring prothrombin time (PT) expressed as INR. Two main methods exist for PT analysis. The Owren method is used mainly in the Nordic and Baltic countries, in Japan, whereas the Quick method is employed in most other countries. Warfarin management is associated with some complications. Unlike many other drugs the dose for a given patient cannot be estimated beforehand, dose-response relationship is not predictable, and the prevention of thrombosis must be balanced against the risk of bleeding. Furthermore, the different PT methods used to monitor the drug are sometimes not in agreement and show significant discrepancies in results.

In an attempt to clarify the mechanisms influencing the inter-individual variations in warfarin therapy and to detect the factors that contribute to differences between PT methods, studies were conducted in collaboration with hospitals and anticoagulation clinics in the south-eastern region of Sweden. First, a stereo-specific HPLC method for measurement of warfarin enantiomers was developed and validated. With this method, the levels of plasma warfarin following its oral administration can be studied and evaluated. Abnormal clearance in some patients can be detected, and patient compliance can be verified. Furthermore, differing ratios of (S)- and (R)-isomers can be identified.

The impact of common VKORC1 polymorphisms on warfarin therapy was investigated. This study has shown that the VKORC1*2 haplotype is an important genetic determinant for warfarin dosage and is associated with difficulties in attaining and retaining therapeutic PT-INR. Further, significant differences in warfarin S/R-ratio was detected between patients with VKORC1*2 and VKORC1*3 or VKORC1*4 variants. This difference was not coupled with CYP2C9 genotype.

The effects of predilution of patient plasma samples, sources of thromboplastin and deficient plasma on between PT methods agreement were studied. This study has revealed that sample predilution according to the Owren method is to be preferred for the harmonisation of PT results. Undiluted samples, in contrast, according to the Quick method have shown reduced correlation between two different thromboplastin reagents. Sources of thromboplastin and deficient plasma were only of minor importance.

Almost precisely a century ago, in the 1920s and 1930s, cattle bled to death in North America after being fed moldy hay containing sweet clover, the yellow Melilotus officinalis, and the white Melilotus albus. The toxic substance in the hay inhibiting blood coagulation was identified and named dicumarol. Further development resulted in warfarin, an oral anticoagulant that has been used for over 70 years and still is, even though newer direct-acting oral anticoagulants (DOACs) are mainly replacing it. For some patients, warfarin is still the drug of choice. A safe warfarin treatment needs repeated blood sample analysis (PT-INR), and with the new DOACs come new laboratory challenges. The aim of this thesis was to investigate ways laboratory methods can contribute to improving oral anticoagulant treatment. 

Paper I explores genetic variants of the enzyme targeted by warfarin, VKORC1. The result shows that the haplotype VKORC1*2 is the most important of the VKORC1 haplotypes for warfarin dosage, with a lower dose requirement. The VKORC1*2 haplotype was also related to more unstable PT-INR levels. 

Paper II describes a cross-section study comparing warfarin treatment control, as PT-INRs within the intended therapeutic range, in primary health care centers (PHCCs) and specialized anticoagulation clinics (ACCs). Both settings showed good therapeutic control, with at least as good therapeutic control in the PHCCs as in the ACCs. Today, almost all warfarin treatment in our region is centralized to ACCs. 

Paper III focuses on the modification of a point-of-care PT method. A ratio of PT from two different dilutions of each patient sample was calculated and used as an indirect measure of DOAC activity. There were close correlations between the PT ratio and drug concentrations measured at the hospital laboratory. The detection level varies between DOACs and may limit its use in some situations. 

Paper IV evaluated the MRX PT DOAC, an assay based on the PT ratio principle. It was found to be able to detect potentially interfering DOAC levels in plasma samples. Confirmatory testing is recommended, as is sensitivity improvement for the detection of specific interferences.   

För nästan exakt 100 år sedan dog boskap i Nordamerika av stora blödningar. Det skulle visa sig att det berodde på att de utfodrats med mögligt hö innehållande gul och vit sötväppling, Melilotus officinalis och Melilotus albus. Den giftiga substans som bildas hindrar blodet från att koagulera. Forskare lyckades identifiera och renframställa substansen, och en vidareutveckling av den gav upphov till warfarin, ett “blodförtunnande” läkemedel (antikoagulantia) i tablettform. Warfarin används än idag, även om nya antikoagulantialäkemedel används allt oftare. För vissa patienter är warfarin ännu det bästa läkemedlet. Warfarinbehandlade patienter kontrolleras regelbundet med analys PK-prov på laboratorium för att behandlingen ska vara säker, och med de nya läkemedlen kommer nya analysutmaningar. Målsättningen med den här avhandlingen har varit att undersöka olika sätt som laboratoriemetoder kan bidra till att förbättra antikoagulantiabehandling.

I delarbete I har vi sett att det finns en koppling mellan vissa genetiska varianter och ett lägre behov av warfarin, och likaså en mer svårinställd behandling.

I delarbete II undersökte vi kvaliteten på warfarinbehandlingen i primärvård jämfört med specialiserade antikoagulantia(AK-)mottagningar genom jämförelse av hur PK-proven under en viss vecka förhöll sig till önskade värden. Båda vårdformerna visade god kvalitet på warfarinbehandlingen, minst lika bra i primärvården som på AK-mottagningarna. Sedan studien gjordes har nästan all warfarinbehandling centraliserats till AK-mottagningar.

I delarbete III modifierade vi en analysmetod som vanligen används för analys av PK-prov, med sikte på att också kunna använda den för analys av effekt av de nya antikoagulantialäkemedlen. Vi såg en god överensstämmelse mellan den modifierade metodens resultat och ordinarie analys.

I delarbete IV utvärderade vi MRX PT DOAC, en analysmetod som bygger på den princip som beskrivs i delarbete III. Vi använde MRX PT DOAC för att upptäcka prover med läkemedel som kan störa andra analyser. Vi såg goda resultat men också förbättringspotential.